肿瘤自身抗体标志物的研究进展
肿瘤自身抗体标志物的研究进展
2018年3月1日
李阳，郭书娟，陶生策
上海交通大学系统生物医学研究院，系统生物医学教育部重点实验室
摘要：肿瘤发生时，机体免疫系统针对肿瘤相关性抗原（tumor associated antigens，TAAs）产生免疫反应和自身抗体。大量研究表明，自身抗体在肿瘤发生早期可在血液中被检测到，因此在肿瘤早期诊断方面具有较大应用潜力。另外，自身抗体水平在肿瘤手术后显著性下降，因此自身抗体也可用于术后监测，并且由于肿瘤的异质性和个体差异，不同病人的自身抗体也可能存在差异，因此需以精准医疗的思想实施个体化监测。但目前，由于缺乏有效的工具，对肿瘤自身抗体的研究还较为落后，系统性地发现和鉴定肿瘤自身抗体存在较大挑战。蛋白质芯片，作为一个涵盖大量不同蛋白的抗原库，是一个全新的工具，为发现肿瘤自身抗体提供了有力的支撑。就肿瘤自身抗体标志物的应用潜力和研究方法进行了总结和评论。
关键词：肿瘤；自身抗体；早期诊断；个体化术后监测；蛋白质芯片
恶性肿瘤是威胁人类生命健康的一类重大疾病。虽然经过科学家和临床医生的努力，肿瘤的治疗有了长足的进步，但高死亡率仍未得到有效控制[1]。根据国家癌症中心的统计数据，我国每年恶性肿瘤的新发病例约为430万，死亡病例约为280万[2]。肿瘤血清学标志物 对于肿瘤防治有重要价值，可通过筛查血清标志物发现早期病变、进行术后评估以及术后监测等[3]。其中，自身抗体，即机体针对肿瘤抗原发生免疫响应而产生的特异性抗体，在肿瘤的早期诊断和术后监测具有较大的应用潜力[1，4-5]。
1 肿瘤自身抗体产生的机制
早在20世纪60年代，Baldwin[6]发现机体可针对肿瘤产生免疫反应。经大量研究验证，在肿瘤发生过程中，异常表达的蛋白可刺激机体免疫系统，产生抗体，这些蛋白被称为肿瘤相关抗原（tumorassociated antigens，TAAs）或肿瘤特异性抗原（tumor-speci fi c antigens，TSAs），对应的抗体称为自身抗体（autoantibody）[7]。自身抗体产生的机制目前尚不完全明确，主流的理论假说是免疫监视理论（immune surveillance）[4，7-8]，即肿瘤在发生过程中受到免疫系统的攻击，诱导T细胞主导的细胞免疫和B细胞主导的体液免疫。为了对抗这种攻击，肿瘤细胞利用一系列的机制产生免疫逃逸，比如诱发免疫检查点蛋白PD-L1通路、抑制T细胞活性。免疫治疗通过抑制这种对抗或重新激活T细胞表现出肿瘤治疗的潜力[9]。而B细胞针对肿瘤抗原产生抗体，即自身抗体，释放到血液中（图1）[8，10]。最近的一些研究表明，B细胞及肿瘤自身抗体对于肿瘤的免疫治疗或许有较大的辅助作用[11-12]。能够引起机体产生免疫反应的抗原包括异常高表达、突变、错误折叠、错误定位以及修饰异常等的蛋白[13]，蛋白的来源包括核蛋白、细胞质蛋白等，蛋白的种类涉及细胞周期蛋白、RNA结合蛋白以及生长因子等 [3，14]。
图1 肿瘤自身抗体产生的过程[10]
其中，p53抗体是最具代表性、研究最为广泛的肿瘤相关自身抗体。p53是抑癌基因TP53的产物，参与细胞周期调控，引导DNA修复和细胞凋亡。已有研究表明超过50%的癌症病人中存在p53基因突变（主要发生在DNA结合结构域），突变后的蛋白失去调控功能，容易发生细胞癌变。另外，突变的p53稳定性增加（半衰期延长），导致其在细胞核中累积[15]，从而刺激免疫反应导致自身抗体的出现。p53抗体最早由Crawford等[16]于1982年发现，广泛出现在各种类型的肿瘤病人的血液中，很少在健康人中被检测到，因此其特异性较高（96%），但跟其他自身抗体类似，p53抗体仅在约30%的肿瘤病人中可被检测到，因此灵敏度偏低。然而研究发现，p53抗体先于临床症状几个月至几年即可出现，因此可用于高危人群的筛查[15]，并且和治疗有密切的相关性，可作为肿瘤复发的检测指标[17-18]。
2 自身抗体在早期诊断中的应用
自身抗体用于肿瘤早期诊断的价值已获得广泛认可，在多种类型的肿瘤中已经发现多个TAAs，并且有诸多综述文献对肿瘤（如肝癌[19]、肺癌[20]、食管癌[21]、结直肠癌[22]等）的TAAs进行了全面的总结和分析，代表性的TAAs包括p53、c-myc等抑癌基因蛋白或驱动基因蛋白、MAGE-A蛋白家族、NY-ESO-1等CT抗原（cancer-testis antigen）以及其他多种类型的蛋白。作为早期诊断的一类指标，自身抗体具有以下特点。①伴随肿瘤的发生过程产生，先于临床症状，适用于早期诊断。肿瘤的发生是一个不易察觉的过程，而目前的诊断往往基于影像学且需要有明显的临床症状作为依据。然而，自身抗体可先于临床症状几个月到几年出现明显增加。Zhang等[23]基于回顾性研究发现，在肝癌病人确诊之前，血清中抗核抗体水平显著升高，针对自身抗原p62的抗体水平也是如此。Liu等 [24]同样在肝癌病人血清中发现抗原MDM2的自身抗体，并基于一系列不同时间点的样本检测发现，在确诊之前6～9个月，该自身抗体水平已有显著提高。②自身抗体的产生是免疫反应的结果，经过免疫系统的放大，抗体更容易被检测[25-26]。大多数蛋白质在血液中不稳定，且含量很低。而抗体比较稳定，经过B细胞增殖的多级放大，可在一周内放大11个数量级，因此更容易被检测。③具有特定类型肿瘤特异性。研究发现一些抗原是肿瘤特有的，但不同肿瘤间无特异性（如p53）；也有一些抗原是某种肿瘤特异性的（如前列腺癌的与氧化应激相关的蛋白[13]）。④对于一个特定的TAA，其自身抗体仅出现在10%～30%的病人中[14-15，27]，作为诊断工具，其灵敏度偏低。这可能源于肿瘤的异质性或者免疫反应的多样性。因此，建立一个标志物组合，联合多个TAAs是一种有效的策略，在维持较高特异性的前提下，提高检测灵敏度，从而可应用于临床诊断。例如，Zhang等[28]建立了一个含有8个自身抗体标志物的组合 （IMP1、IMP2、IMP3、c-myc、p53、survivin、cyclin B1和p16），可以将检测灵敏度提高至60%，将特异性提高到82.4%。
目前市场上已经出现了商业化试剂盒。英国Oncimmune公司推出的肺癌检测试剂盒EarlyCDT®-Lung，基于对7种自身抗原（CAGE、HuD、NYESO-1、SOX-2、GBU4-5、MAGE-A4和p53）的检测，检测灵敏度为41%、特异性为91%、准确度为92%，能够与目前主流的肺癌筛查方法低剂量CT形成互补，降低其假阳性率[29-30]。研究发现该产品在早期诊断中具有优势 （20%早期可检测，可早于临床症状5年检测出）。基于此产品，英国国民医疗服务体系（National Health Service，NHS） 主导启动了ECLS项目，已招募12000名高危病人，系统性地对Early CDT®-Lung早期筛查的价值进行前瞻性评估，2016年12月公布的初步结果显示其具有比预期高的灵敏度和很好的早期诊断价值，整个项目完成时间在2019年。杭州凯保罗生物有限公司也成功开发了肺癌检测试剂盒，该试剂盒包含7种自身抗体（p53、GAGE7、PGP9.5、CAGE、MAGE-A1，SOX-2和GBU4-5抗体）的检测，是首个被国家食品药品监督管理总局（CFDA） 批准的用于联合低剂量螺旋CT的肺癌检测试剂盒，在肺癌早期检测领域有重要的意义 （国械注准20153402087）。另外，美国Provista公司（实验室获得CLIA和CAP认证）开发的Videssa®Breast乳腺癌早期诊断试剂盒，包含23个蛋白和自身抗体检测指标，阴性预测率高达98%～99.3%，可将乳房X射线的影像学检测的假阳性率降低73%，从而减少乳腺癌的过度治疗。
3 自身抗体在个体化肿瘤术后监测中的应用
肿瘤相关自身抗体在预后的临床作用中也有诸多报道。整体上，较多报道发现p53阳性的病人呈现更高的复发率和死亡率[31-32]。但是，也有的研究结论相反或显示无显著性影响[33-34]。但是肿瘤自身抗体标志物浓度的变化在术后复发监测过程中可能发挥很大的作用。自身抗体依赖于肿瘤的持续刺激而存在[15]，因此，肿瘤被切除后，由于缺乏抗原的持续刺激，相应的自身抗体逐渐减少，并维持在低浓度状态，在复发时再次增高，因此自身抗体具有复发监测的价值[31]。其中，研究最多、最具代表性的是p53自身抗体。
图2 肿瘤病人CC24（a）和CC37（b）术后p53抗体浓度变化曲线[35]
1995年，Thierry团队报道了一个肺癌病人血清中p53抗体在诊断前、手术后的变化情况[17]。在肺癌临床诊断前几个月，p53抗体浓度呈现逐渐升高的趋势并到达高峰，之后采取手术治疗，发现p53抗体浓度急剧下降，其下降速率接近IgG在体内自然代谢的速率（IgG在血液中的半衰期为21～30天[35]），直到下降到接近发病之前的浓度水平。接着，该团队在多个结肠癌病人中发现了类似的情况（图2）[36]。图2展示了两个代表性病人的情况。病人CC24［图2（a）］接受手术治疗后，p53抗体浓度出现了显著下降并在化疗的过程中维持在较低的水平，14个月后，p53抗体浓度上升，于第16个月时检测到复发并再次实施手术，p53抗体浓度则对应再次降低，而CEA和CA199浓度则并无相关性表现。病人CC37［图2（b）］在接受放疗后，p53抗体浓度出现下降，之后肿瘤手术切除，而后又回升，发现肝脏转移，进行手术切除后再次观察到下降。以上均反映出p53抗体浓度与疾病进程显著相关，而CEA和CA199浓度则并无相关性表现。该团队后续增加了肺癌样本的数量，系统性地分析了12个p53自身抗体阳性的肺癌病人[37]，发现手术治疗后，75%（12/16）的病人血清中的p53抗体浓度出现了＞50%的下降，在4个归为未出现显著下降的病人中，3个被检测到有下降的趋势。另外，同时检测了HAV抗体作为基线对照，从而严格证明了p53抗体的变化是肿瘤进程特异的。
Saffroy等[38]研究了9个肝癌病人中p53抗体的变化。在8个有效的病人数据中，6个肝癌病人在手术后出现了显著p53抗体浓度下降，但是若不考虑后续的抗体浓度波动，1～3个月内，病人均表现出p53抗体浓度下降。Takeda等[39]在另外一项研究中，分析了17个p53抗体阳性的病人治疗前后的变化，发现所有病人血清中p53抗体浓度在术后出现下降，且16个病人p53抗体由阳性转为阴性。
在大规模乳腺癌的研究中，Metcalfe等[40]检测了1006位病人治疗后血清样本中的p53抗体，跟踪的血清样本总数超过8000例，结果发现在155位p53抗体呈现阳性的病人，大部分治疗后p53抗体浓度并未出现减少或消失。这个结论似乎与先前研究相反。但是，作者认为这是因为病人的治疗并非采用手术切除，而是采用放射治疗的方式。一方面，肿瘤细胞依然残留；另一方面，放射治疗可能对正常组织细胞造成损伤而释放p53抗原，由于抗原的持续刺激并未消失，p53抗体仍处于阳性。这表明治疗方式可能有很大的影响，同样是乳腺癌，在另一项研究发现p53抗体在术后复发监测中具有重要价值[41]。
综上所述，p53自身抗体浓度会在手术（或其他治疗）后出现显著下降，并在复发前出现回升，其浓度变化跟疾病进程高度相关。虽然对于p53抗体阳性的肿瘤病人，大部分在术后会出现抗体浓度下降，但是p53在肿瘤病人中的阳性率仅为20%～30%。因此，作为术后评估较有意义。对于p53阴性的病人，则需要寻找新的自身抗体标志物。精准医疗是在充分考虑个体化差异的基础上提出来的，自身抗体的特征与肿瘤个体化差异的特点完全一致。若能比较手术前后，发现个体特异的自身抗体，即可实现个体化的复发监测，对于肿瘤防治具有重要意义。
4 发现自身抗体的方法和手段
自身抗体均是由其识别的抗原进行定义的，筛选、发现自身抗体（或抗原）的方法均基于免疫检测，本质上是抗原库的制备和免疫筛选的建立（图3）。抗原的来源包括重组表达蛋白、cDNA表达库、细胞或组织分离的蛋白质组；筛选方法主要是免疫印迹和高通量蛋白质芯片；后续基于测序或质谱的方式鉴定TAAs。主要的研究方法和工具方法如下。
图3 肿瘤自身抗体研究的方法[42]
4.1 SEREX
SEREX（serological analysis of tumor antigens by recombinant cDNA expression cloning）方法由Sahin等[43]于1995年建立，基于从病人的肿瘤组织获得总RNA，通过逆转录得到cDNA文库，建立噬菌体克隆库再转染到大肠杆菌中，通过固体培养和诱导表达重组蛋白并转移到膜上，对该病人的血清进行免疫检测，阳性克隆通过测序获得抗原信息[14]。目前，应用SEREX技术，已鉴定出多种TAAs[14，44]。但是该方法在建库的过程中往往存在蛋白表达不均衡，更偏向于表达组织中高丰度的抗原，导致一些低丰度蛋白难以检测。另外，整个实验过程步骤繁多，抗原库来源和血清的量都受到较大限制，因此不适用于大量样本的筛选，无法消除个体差异以及自身抗体多样性导致的偶然性。
类似的技术还有噬菌体库筛选[5，45]，不直接进行转膜和血清筛选，而是采用多血清和多轮筛选的方式，一般先进行健康对照，再进行病人血清样本的富集，获得的阳性克隆同样采用基因测序的方式获得抗原信息。
4.2 SERPA
SERPA（serological proteome analysis） 直接基于组织或细胞裂解液，通过二维电泳进行分离，并进行血清的免疫印迹，阳性或差异性的蛋白通过质谱得以鉴定[44-46]。该方法的优势是基于天然样本而非重组蛋白，因此能最大程度地保持蛋白的翻译后修饰（PTMs）和剪切体形式。但是同样存在蛋白丰度不均匀的问题，对于低丰度蛋白无法有效检测，另外，实验过程严重依赖人员操作，二维电泳和免疫印迹较难于重复。
4.3 MAPPing
MAPPing（multiple af fi nity protein pro fi ling）基于肿瘤组织和细胞裂解液，首先用磁珠固定的健康对照组的血清去除与之结合的蛋白，再使用来自肿瘤病人的血清捕获剩余的蛋白，然后通过质谱鉴定[44]。这种方法类似于噬菌体库筛选，不同的是抗原库源于天然样本，无法多次筛选和富集，存在一定的假阳性和假阴性。
4.4 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片（protein microarray）技术根据抗原库来源不同分为两种形式[14]。一是将特定抗体固定于芯片表面，首先捕获肿瘤组织或细胞裂解液中的蛋白，再基于高通量血清学检测获得差异性或阳性蛋白，通过抗体的特异性确定抗原信息。优势在于可以分析天然抗原和天然构象表位，但这种方法依赖于抗体的个数和质量，很难获得足够的抗原库。另外一种是重组蛋白质芯片，即将确定的重组蛋白直接固定于芯片表面，进而进行血清学筛选，这是最直接的一种方式，同时满足高通量和大量样本筛选的需求。但是获得足够种类的重组蛋白是一个瓶颈[44]。
5 蛋白质芯片在自身抗体检测及研究中的应用
蛋白质芯片，或蛋白质微阵列，是将多种蛋白质以阵列的形式排布和固定在固相表面。蛋白质芯片具有高通量、微型化、样本消耗少等优点。以目前的芯片技术，一张载玻片大小的芯片上可点制4万～6万个点，可承载巨大的抗原库，且由于每个点之间是独立的，可进行直接结果解读，适合高通量、大规模样本的筛选和检测[47]。
ProtoArray®芯片是来自Thermo Fisher Scienti fi c公司的一款高通量蛋白质芯片，包含约9000个重组人蛋白质，该芯片已经广泛应用于多种自身免疫性疾病和肿瘤的自身抗体的研究，包括慢性肾移植损伤、哮喘、结直肠癌和前列腺癌等[48]。
HuProtTM芯片同ProtoArray芯片相似，同是以纯化的、重组表达的蛋白质制备，但是蛋白个数更多，目前已达到20240个重组人蛋白，涵盖约16000个基因，是目前世界上最高通量的蛋白质芯片[47，49-50]。HuProtTM人类蛋白质组芯片由Johns Hopkins大学的朱衡教授团队开发，89%的蛋白为全长蛋白，部分蛋白包含多个不同的剪切体形式，通过高通量重组蛋白质制备方式获得，表达宿主是酵母，纯化方式为GST标签亲和纯化[50]。该款蛋白质芯片已应用于自身免疫性肝炎[51]、系统性红斑狼疮[52]、白塞病[53]等自身免疫性疾病，以及胃癌[54]、黑色素瘤[55]等恶性肿瘤的生物标志物的发现。
图4展示了基于HuProtTM芯片进行血清抗体检测的原理。首先，血清以一定稀释比例同封闭后的芯片进行孵育，并洗去未结合的抗体，再使用不同荧光标记的二抗同时检测IgG抗体亚型和IgM抗体亚型，然后通过荧光扫描仪读取各蛋白点的信号。
基于该款芯片，笔者课题组进行了胃癌自身抗体标志物研究[54]，在发现阶段筛选了37例胃癌患者和50例性别和年龄匹配的健康者，发现了17个新的潜在TAAs，其自身抗体浓度在胃癌患者中显著升高。接下来，针对这17个抗原，筛选了914例样本，包括300例胃癌患者，200例健康者，314例胃部良性病变样本，如胃溃疡、胃炎和息肉。通过大样本统计学验证，最终确定了4个胃癌相关自身抗原，分别是COPS2、CTSF、NT5E和TERF1，其中CTSF的曲线下面积（area under curve，AUC）达到0.96，针对健康者对照的诊断特异性和灵敏度分别是88%和96%。以上结果同时通过ELISA平台得到了验证。目前，正在同诊断公司合作进行该组标志物临床检测用试剂盒的开发。在另外一项研究中，Pan等[56]基于HuProtTM芯片筛选了大量肺癌病人的血清样本，经过发现、芯片验证、ELISA验证3个阶段，共检测了1101例血清，发现3个自身抗体标志物，对应抗原蛋白分别是p53、ETHE1和HRas，针对早期肺癌，检测灵敏度47.7%，特异性为90.8%。
图4 HuProtTM蛋白质芯片用于血清自身抗体标志物检测的原理
HuProtTM蛋白质组芯片在发现肿瘤自身抗体标志物方面有独特的优势。第一，蛋白质库较大，涵盖近80%的编码基因且89%的蛋白为全长蛋白，从而可保证抗原蛋白的三维构象。另外，高通量芯片使得检测过程异常简便，免去了抗原鉴定的复杂步骤，通过芯片扫描即可获取全部蛋白抗原的自身抗体信号。简便的过程使得系统误差较小，因此可保证实验的一致性。第二，适用于大规模样本筛选。微型化的芯片可同时进行多个样本的并行分析，传统方法则很难同时进行多个样本的检测。一方面自身抗体存在较大个体差异，小样本量筛选或将样本混合以获得统计学结果必然降低筛选的成功率；另一方面，在研究同一病人不同时间点的一系列样本时，需要同时检测多个样本。第三，所消耗的样本量较少。由于微型化，检测所有蛋白所需要的血清样本量仅为100μL以下，极大节省了宝贵的临床样本。因此，HuProtTM芯片是一个高效的自身抗体研究工具，可大大提高标志物筛选的覆盖率和效率，在疾病相关标志物发现领域有较大应用潜力。
6 总结和展望
肿瘤自身抗体的产生是肿瘤发生过程中机体免疫应答的结果。诸多研究表明，自身抗体往往出现在肿瘤发生的早期，因此具有真正意义上的早期诊断的潜力。目前，多个肿瘤相关性抗原已被发现和鉴定，并且肺癌早期筛查上已经出现了商业化产品。除此之外，自身抗体在术后监测过程中可能发挥更大的作用。自身抗体依赖于肿瘤的持续刺激而存在，因此，肿瘤被切除后，自身抗体逐渐减少，并维持在低浓度状态，在复发时浓度再次升高，因此自身抗体可用于复发监测；但是，由于个体差异，不同肿瘤病人的自身抗原可能不同，所以必须以精准医疗的思维实施个体化筛查和监测。然而，受限于研究工具和样本的可获得性，该类研究目前仅局限于p53等特定TAAs，目前并未进行广泛地筛选以建立全面覆盖的个体化复发监测的标志物组合。
肿瘤自身抗体研究依赖于抗原库，传统的方法已不能满足全局性的筛查和大规模样本验证。蛋白质芯片，特别是包含有约20000个重组人蛋白的HuProtTM芯片提供了高效的方式，可进行大量样本的快速筛选和验证，有望推动自身抗体作为标志物的研究进程。
肿瘤相关性自身抗体领域仍有诸多问题未被解决。比如，目前自身抗体产生的分子机制仍不清晰；所产生的自身抗体，是否具备抗肿瘤作用，还是具备其他功能。另外，在肿瘤免疫治疗的大背景下，有报道发现，自身抗体的存在与否可以预测免疫治疗的效果[57]，或许具备伴随诊断的价值。基于T细胞的免疫治疗研究进行得如火如荼，但仍只对部分人群有效，随着技术的进步和对肿瘤免疫机制研究的深入，或许将来基于自身抗体的免疫治疗也能成为一种有效的治疗方式。
参考文献
［1］ ETZONI R，URBAN N，RAMSEY S，et al. The case for early detection[J]. Nat Rev Cancer，2003，3（4）：243-252.
［2］ ACADEMY R Z C，ACAD C. Cancer Statistics in China，2015[J]. CA CANCER J CLIN，2016，66：115-132.
［3］ HANASH S M，BAIK C S，KALLIONIEMI O. Emerging molecular biomarkers-blood-based strategies to detect and monitor cancer[J]. Nat Rev Clin Oncol，2011，8（3）：142-150.
［4］ FINN O J. Immune response as a biomarker for cancer detection and a lot more[J]. N Engl J Med，2012，1288-1290.
［5］ WANG X，YU J，SREEKUMAR A，et al. Autoantibody signatures in prostate cancer[J]. N Engl J Med，2005，353（12）：1224-1235.
［6］ BALDWIN R W. Tumour-specific immunity against spontneous rat tumours[J]. Int J Cancer，1966，1（3）：257-264.
［7］ ZAENKER P，GRAY E S，ZIMAN M R. Autoantibody production in cancer——the humoral immune response toward autologous antigens in cancer patients[J]. Autoimmun Rev，2016，15（5）：477-483.
［8］ KONSOULOVA A. Principles of cancer immunobiology and immunotherapy of solid tumors[J]. Immunopathol Immunomodulation，2015：78-99.
［9］ SHARMA P，ALLISON J P. The future of immune checkpoint therapy[J]. Science，2015，348：56-61.
［10］ JULIEN S，VIDEIRA P A，DELANNOY P. Sialyl-Tn in cancer：(how)did we miss the target? [J]. Biomolecules，2012，2（4）：435-466.
［11］ CARMI Y，SPITZER M H，LINDE I L，et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity[J]. Nature，2015，521（7550）：99-104.
［12］ SHEN M，SUN Q，WANG J，et al. Positive and negative functions of B lymphocytes in tumors[J]. Oncotarget，2016，7（34）：55828-55839.
［13］ CASIANO C A，MEDIAVILLA-VARELA M，TAN E M. Tumorassociated antigen arrays for the serological diagnosis of cancer[J].Mol Cell proteomics，2006，5（10）：1745-1759.
［14］ DESMETZ C，MANGE A，MAUDELONDE T，et al. Autoantibody signatures：progress and perspectives for early cancer detection[J]. J Cell Mol Med，2011，15（10）：2013-2024.
［15］ SOUSSI T. p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer：a review[J]. Cancer Res，2000，60：1777-1788.
［16］ CRAWFORD L V，PIM D C，BULBROOK R D. Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer[J]. Int J Cancer，1982，30：403-408.
［17］ LUBIN R，ZALCMAN G，BOUCHET L，et al. Serum p53 antibodies as early markers of lung cancer[J]. Nat Med，1995，1（7）：701-702.
［18］ ZALCMAN G，SCHLICHTHOLZ B，TRÉDANIEL J，et al.Monitoring of p53 autoantibodies in lung cancer during therapy：relationship to response to treatment[J]. Clin Cancer Res，1998，4（6）：1359-1366.
［19］ PAN X，GAO Y，LIU J，et al. Progress in studies on autoantibodies against tumor-associated antigens in hepatocellular carcinoma[J].Transl Cancer Res，2016，5（6）：845-859.
［20］ BROODMAN I，LINDEMANS J，VAN STEN J，et al. Serum protein markers for the early detection of lung cancer：a focus on autoantibodies[J]. J Proteome Res，2017，16（1）：3-13.
［21］ ZHANG H，XIA J，WANG K，et al. Serum autoantibodies in the early detection of esophageal cancer：a systematic review[J]. Tumour Biol，2015，36（1）：95-109.
［22］ CHEN H，WERNER S，TAO S，et al. Blood autoantibodies against tumor-associated antigens as biomarkers in early detection of colorectal cancer[J]. Cancer Lett，2014，346（2）：178-187.
［23］ ZHANG J Y，ZHU W，IMAI H，et al. De-novo humoral immune responses to cancer-associated autoantigens during transition from chronic liver disease to hepatocellular carcinoma[J]. Clin Exp Immunol，2001，125（1）：3-9.
［24］ LIU M，ZHENG S J，CHEN Y，et al. Autoantibody response to murine double minute 2 protein in immunodiagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. J Immunol Res，2014. DOI：10.1155/2014/906532.
［25］ HONG Y，HUANG J. Autoantibodies against tumor-associated antigens for detection of hepatocellular carcinoma[J]. World J Hepatol，2015，7（11）：1581-1585.
［26］ DAI L，REN P，LIU M，et al. Using immunomic approach to enhance tumor-associated autoantibody detection in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Clin Immunol，2014，152（1-2）：127-139.
［27］ ZHANG J Y，CHAN E K，PENG X X，et al. A novel cytoplasmic protein with RNA-binding motifs is an autoantigen in human hepatocellular carcinoma[J]. J Exp Med，1999，189（7）：1101-1110.
［28］ ZHANG J Y，MEGLIORINO R，PENG X X，et al. Antibody detection using tumor-associated antigen mini-array in immunodiagnosing human hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol，2007，46：107-114.
［29］ JETT J R，PEEK L J，FREDERICKS L，et al. Audit of the autoantibody test，EarlyCDT®-Lung，in 1600 patients：an evaluation of its performance in routine clinical practice[J]. Lung Cancer，2014，83（1）：51-55.
［30］ CHAPMAN C J，HEALEY G F，MURRAY A，et al. EarlyCDT®-Lung test：improved clinical utility through additional autoantibody assays[J]. Tumor Biol，2012，33（5）：1319-1326.
［31］ SOUSSI T. p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer ：a review[J]. Cancer Res，2000，60：1777-1788.
［32］ KUNIZAKI M，FUKUDA A，WAKATA K，et al. Clinical significance of serum p53 antibody in the early detection and poor prognosis of gastric cancer[J]. Anticancer Res，2017，37（4）：1979-1984.
［33］ MITSUDOMI T，SUZUKI S，YATABE Y，et al. Clinical implications of p53 autoantibodies in the sera of patients with nonsmall-cell lung cancer[J]. J Natl Cancer Inst，1998，90（20）：1563-1568.
［34］ ANDERSON K S，WONG J，VITONIS A，et al. p53 Autoantibodies as potential detection and prognostic biomarkers in serous ovarian cancer[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19（3）：859-868.
［35］ MORELL A，TERRY W D，WALDMANN T A. Metabolic properties of IgG subclasses in man[J]. J Clin Invest，1970，49：673-680.
［36］ HAMMEL P，BOISSIER B，CHAUMETTE M，et al. Detection and monitoring of serum p53 antibodies in patients with colorectal cancer[J]. Gut，1997，40：356-361.
［37］ ZALCMAN G，SCHLICHTHOLZ B，TREDANIEL J，et al.Monitoring relationship autoantibodies in lung cancer during therapy ：to response to treatment[J]. Clin Cancer Res，1998，4：1359-1366.
［38］ SAFFROY R，LELONG J，AZOULAY D，et al. Clinical signi fi cance of circulating anti-p53 antibodies in European patients with hepatocellular carcinoma[J]. Br J Cancer，1999，79：604-610.
［39］ TAKEDA A，SHIMADA H，NAKAJIMA K，et al. Serum p53 antibody as a useful marker for monitoring of treatment of super fi cial colorectal adenocarcinoma after endoscopic resection[J]. Int J Clin Oncol，2001，6：45-49.
［40］ METCALFE S，WHEELER T K，PICKEN S，et al. p53 Autoantibodies in 1006 patients followed up for breast cancer[J].Breast Cancer Res，2000，2（6）：438-443.
［41］ REGELE S，VOGL F D，KOHLER T，et al. p53 Autoantibodies can be indicative of the development of breast cancer relapse[J].Anticancer Res，2003，23（1b）：761-764.
［42］ HEO C K，BAHK Y Y，CHO E W. Tumor-associated autoantibodies as diagnostic and prognostic biomarkers[J]. BMB Rep，2012，45（12）：677-685.
［43］ SAHIN U，TURECI O，SCHMITFR H，et al. Human neoplasms elicit multiple speci fi c immune responses in the autologous host[J].Proc Natl Acad Sci，1995，92：11810-11813.
［44］ TAN H T，LOW J，LIM S G，et al. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection[J]. FEBS J，2009，276：6880-6904.
［45］ LIU H，ZHANG J，WANG S，et al. Screening of autoantibodies as potential biomarkers for hepatocellular carcinoma by using T7 phase display system[J]. Cancer Epidemiol，2012，36（1）：82-88.
［46］ TOYE A M，PARSONS S F，ANSTEE D J，et al. Immunoseroproteomic pro fi ling in African American men with prostate cancer：evidence for an autoantibody response to glycolysis and plasminogen-associated proteins[J]. Mol Cell Proteomics，2016（909）：1-28.
［47］ ZHU H. Global analysis of protein activities using proteome chips[J].Science，2001，293（5537）：2101-2105.
［48］ AYOGLU B，SCHWENK J M，NILSSON P. Antigen arrays for profiling autoantibody repertoires[J]. Bioanalysis，2016，8（10）：1105-1126.
［49］ HU S，LI Y，LIU G，et al. A protein chip approach for highthroughput antigen identification and characterization[J].Proteomics，2007，7（13）：2151-2161.
［50］ JEONG J S，JIANG L，ALBINO E，et al. Rapid identification of monospeci fi c monoclonal antibodies using a human proteome microarray[J].Mol Cell Proteomics，2012. DOI：10.1074/mcp.0111.016253.
［51］ HU C J，SONG G，HUANG W，et al. Identification of new autoantigens for primary biliary cirrhosis using human proteome microarrays[J]. Mol Cell Proteomics，2012，11（9）：669-680.
［52］ HU C，HUANG W，CHEN H，et al. Autoantibody profiling on human proteome microarray for biomarker discovery in cerebrospinal fl uid and sera of neuropsychiatric lupus[J]. PLoS One，2015，10（5）：e0126643.
［53］ HU C J，PAN J B，SONG G，et al. Identi fi cation of novel biomarkers for behcet disease diagnosis using human proteome microarray approach[J]. Mol Cell Proteomics，2017，16（2）：147-156.
［54］ YANG L，WANG J，LI J，et al. Identification of serum biomarkers for gastric cancer diagnosis using a human proteome microarray[J].Mol Cell Proteomics，2016，15（2）：614-623.
［55］ SYED P，GUPTA S，CHOUDHARY S，et al. Autoantibody pro fi ling of glioma serum samples to identify biomarkers using human proteome arrays[J]. Sci Rep，2015，5：13895.
［56］ PAN J，SONG G，CHEN D，et al. Identification of serological biomarkers for early diagnosis of lung cancer using a protein array-based approach[J]. Mol Cell Proteomics，2017，16（12）：2069-2078.
［57］ Oncimmune and scancell present data on use of autoantibodies in predicting response to SCIB1 immunotherapy[EB/OL]. [2017-08-29]. http：//www.scancell.co.uk/news/regulatory-news/oncimmune-andscancell-present-data.
转载自《生物产业技术》2018. 02（3月）//www.biobusiness.com.cn/
2018年3月1日
李阳，郭书娟，陶生策
上海交通大学系统生物医学研究院，系统生物医学教育部重点实验室
摘要：肿瘤发生时，机体免疫系统针对肿瘤相关性抗原（tumor associated antigens，TAAs）产生免疫反应和自身抗体。大量研究表明，自身抗体在肿瘤发生早期可在血液中被检测到，因此在肿瘤早期诊断方面具有较大应用潜力。另外，自身抗体水平在肿瘤手术后显著性下降，因此自身抗体也可用于术后监测，并且由于肿瘤的异质性和个体差异，不同病人的自身抗体也可能存在差异，因此需以精准医疗的思想实施个体化监测。但目前，由于缺乏有效的工具，对肿瘤自身抗体的研究还较为落后，系统性地发现和鉴定肿瘤自身抗体存在较大挑战。蛋白质芯片，作为一个涵盖大量不同蛋白的抗原库，是一个全新的工具，为发现肿瘤自身抗体提供了有力的支撑。就肿瘤自身抗体标志物的应用潜力和研究方法进行了总结和评论。
关键词：肿瘤；自身抗体；早期诊断；个体化术后监测；蛋白质芯片
恶性肿瘤是威胁人类生命健康的一类重大疾病。虽然经过科学家和临床医生的努力，肿瘤的治疗有了长足的进步，但高死亡率仍未得到有效控制[1]。根据国家癌症中心的统计数据，我国每年恶性肿瘤的新发病例约为430万，死亡病例约为280万[2]。肿瘤血清学标志物 对于肿瘤防治有重要价值，可通过筛查血清标志物发现早期病变、进行术后评估以及术后监测等[3]。其中，自身抗体，即机体针对肿瘤抗原发生免疫响应而产生的特异性抗体，在肿瘤的早期诊断和术后监测具有较大的应用潜力[1，4-5]。
1 肿瘤自身抗体产生的机制
早在20世纪60年代，Baldwin[6]发现机体可针对肿瘤产生免疫反应。经大量研究验证，在肿瘤发生过程中，异常表达的蛋白可刺激机体免疫系统，产生抗体，这些蛋白被称为肿瘤相关抗原（tumorassociated antigens，TAAs）或肿瘤特异性抗原（tumor-speci fi c antigens，TSAs），对应的抗体称为自身抗体（autoantibody）[7]。自身抗体产生的机制目前尚不完全明确，主流的理论假说是免疫监视理论（immune surveillance）[4，7-8]，即肿瘤在发生过程中受到免疫系统的攻击，诱导T细胞主导的细胞免疫和B细胞主导的体液免疫。为了对抗这种攻击，肿瘤细胞利用一系列的机制产生免疫逃逸，比如诱发免疫检查点蛋白PD-L1通路、抑制T细胞活性。免疫治疗通过抑制这种对抗或重新激活T细胞表现出肿瘤治疗的潜力[9]。而B细胞针对肿瘤抗原产生抗体，即自身抗体，释放到血液中（图1）[8，10]。最近的一些研究表明，B细胞及肿瘤自身抗体对于肿瘤的免疫治疗或许有较大的辅助作用[11-12]。能够引起机体产生免疫反应的抗原包括异常高表达、突变、错误折叠、错误定位以及修饰异常等的蛋白[13]，蛋白的来源包括核蛋白、细胞质蛋白等，蛋白的种类涉及细胞周期蛋白、RNA结合蛋白以及生长因子等 [3，14]。
图1 肿瘤自身抗体产生的过程[10]
其中，p53抗体是最具代表性、研究最为广泛的肿瘤相关自身抗体。p53是抑癌基因TP53的产物，参与细胞周期调控，引导DNA修复和细胞凋亡。已有研究表明超过50%的癌症病人中存在p53基因突变（主要发生在DNA结合结构域），突变后的蛋白失去调控功能，容易发生细胞癌变。另外，突变的p53稳定性增加（半衰期延长），导致其在细胞核中累积[15]，从而刺激免疫反应导致自身抗体的出现。p53抗体最早由Crawford等[16]于1982年发现，广泛出现在各种类型的肿瘤病人的血液中，很少在健康人中被检测到，因此其特异性较高（96%），但跟其他自身抗体类似，p53抗体仅在约30%的肿瘤病人中可被检测到，因此灵敏度偏低。然而研究发现，p53抗体先于临床症状几个月至几年即可出现，因此可用于高危人群的筛查[15]，并且和治疗有密切的相关性，可作为肿瘤复发的检测指标[17-18]。
2 自身抗体在早期诊断中的应用
自身抗体用于肿瘤早期诊断的价值已获得广泛认可，在多种类型的肿瘤中已经发现多个TAAs，并且有诸多综述文献对肿瘤（如肝癌[19]、肺癌[20]、食管癌[21]、结直肠癌[22]等）的TAAs进行了全面的总结和分析，代表性的TAAs包括p53、c-myc等抑癌基因蛋白或驱动基因蛋白、MAGE-A蛋白家族、NY-ESO-1等CT抗原（cancer-testis antigen）以及其他多种类型的蛋白。作为早期诊断的一类指标，自身抗体具有以下特点。①伴随肿瘤的发生过程产生，先于临床症状，适用于早期诊断。肿瘤的发生是一个不易察觉的过程，而目前的诊断往往基于影像学且需要有明显的临床症状作为依据。然而，自身抗体可先于临床症状几个月到几年出现明显增加。Zhang等[23]基于回顾性研究发现，在肝癌病人确诊之前，血清中抗核抗体水平显著升高，针对自身抗原p62的抗体水平也是如此。Liu等 [24]同样在肝癌病人血清中发现抗原MDM2的自身抗体，并基于一系列不同时间点的样本检测发现，在确诊之前6～9个月，该自身抗体水平已有显著提高。②自身抗体的产生是免疫反应的结果，经过免疫系统的放大，抗体更容易被检测[25-26]。大多数蛋白质在血液中不稳定，且含量很低。而抗体比较稳定，经过B细胞增殖的多级放大，可在一周内放大11个数量级，因此更容易被检测。③具有特定类型肿瘤特异性。研究发现一些抗原是肿瘤特有的，但不同肿瘤间无特异性（如p53）；也有一些抗原是某种肿瘤特异性的（如前列腺癌的与氧化应激相关的蛋白[13]）。④对于一个特定的TAA，其自身抗体仅出现在10%～30%的病人中[14-15，27]，作为诊断工具，其灵敏度偏低。这可能源于肿瘤的异质性或者免疫反应的多样性。因此，建立一个标志物组合，联合多个TAAs是一种有效的策略，在维持较高特异性的前提下，提高检测灵敏度，从而可应用于临床诊断。例如，Zhang等[28]建立了一个含有8个自身抗体标志物的组合 （IMP1、IMP2、IMP3、c-myc、p53、survivin、cyclin B1和p16），可以将检测灵敏度提高至60%，将特异性提高到82.4%。
目前市场上已经出现了商业化试剂盒。英国Oncimmune公司推出的肺癌检测试剂盒EarlyCDT®-Lung，基于对7种自身抗原（CAGE、HuD、NYESO-1、SOX-2、GBU4-5、MAGE-A4和p53）的检测，检测灵敏度为41%、特异性为91%、准确度为92%，能够与目前主流的肺癌筛查方法低剂量CT形成互补，降低其假阳性率[29-30]。研究发现该产品在早期诊断中具有优势 （20%早期可检测，可早于临床症状5年检测出）。基于此产品，英国国民医疗服务体系（National Health Service，NHS） 主导启动了ECLS项目，已招募12000名高危病人，系统性地对Early CDT®-Lung早期筛查的价值进行前瞻性评估，2016年12月公布的初步结果显示其具有比预期高的灵敏度和很好的早期诊断价值，整个项目完成时间在2019年。杭州凯保罗生物有限公司也成功开发了肺癌检测试剂盒，该试剂盒包含7种自身抗体（p53、GAGE7、PGP9.5、CAGE、MAGE-A1，SOX-2和GBU4-5抗体）的检测，是首个被国家食品药品监督管理总局（CFDA） 批准的用于联合低剂量螺旋CT的肺癌检测试剂盒，在肺癌早期检测领域有重要的意义 （国械注准20153402087）。另外，美国Provista公司（实验室获得CLIA和CAP认证）开发的Videssa®Breast乳腺癌早期诊断试剂盒，包含23个蛋白和自身抗体检测指标，阴性预测率高达98%～99.3%，可将乳房X射线的影像学检测的假阳性率降低73%，从而减少乳腺癌的过度治疗。
3 自身抗体在个体化肿瘤术后监测中的应用
肿瘤相关自身抗体在预后的临床作用中也有诸多报道。整体上，较多报道发现p53阳性的病人呈现更高的复发率和死亡率[31-32]。但是，也有的研究结论相反或显示无显著性影响[33-34]。但是肿瘤自身抗体标志物浓度的变化在术后复发监测过程中可能发挥很大的作用。自身抗体依赖于肿瘤的持续刺激而存在[15]，因此，肿瘤被切除后，由于缺乏抗原的持续刺激，相应的自身抗体逐渐减少，并维持在低浓度状态，在复发时再次增高，因此自身抗体具有复发监测的价值[31]。其中，研究最多、最具代表性的是p53自身抗体。
图2 肿瘤病人CC24（a）和CC37（b）术后p53抗体浓度变化曲线[35]
1995年，Thierry团队报道了一个肺癌病人血清中p53抗体在诊断前、手术后的变化情况[17]。在肺癌临床诊断前几个月，p53抗体浓度呈现逐渐升高的趋势并到达高峰，之后采取手术治疗，发现p53抗体浓度急剧下降，其下降速率接近IgG在体内自然代谢的速率（IgG在血液中的半衰期为21～30天[35]），直到下降到接近发病之前的浓度水平。接着，该团队在多个结肠癌病人中发现了类似的情况（图2）[36]。图2展示了两个代表性病人的情况。病人CC24［图2（a）］接受手术治疗后，p53抗体浓度出现了显著下降并在化疗的过程中维持在较低的水平，14个月后，p53抗体浓度上升，于第16个月时检测到复发并再次实施手术，p53抗体浓度则对应再次降低，而CEA和CA199浓度则并无相关性表现。病人CC37［图2（b）］在接受放疗后，p53抗体浓度出现下降，之后肿瘤手术切除，而后又回升，发现肝脏转移，进行手术切除后再次观察到下降。以上均反映出p53抗体浓度与疾病进程显著相关，而CEA和CA199浓度则并无相关性表现。该团队后续增加了肺癌样本的数量，系统性地分析了12个p53自身抗体阳性的肺癌病人[37]，发现手术治疗后，75%（12/16）的病人血清中的p53抗体浓度出现了＞50%的下降，在4个归为未出现显著下降的病人中，3个被检测到有下降的趋势。另外，同时检测了HAV抗体作为基线对照，从而严格证明了p53抗体的变化是肿瘤进程特异的。
Saffroy等[38]研究了9个肝癌病人中p53抗体的变化。在8个有效的病人数据中，6个肝癌病人在手术后出现了显著p53抗体浓度下降，但是若不考虑后续的抗体浓度波动，1～3个月内，病人均表现出p53抗体浓度下降。Takeda等[39]在另外一项研究中，分析了17个p53抗体阳性的病人治疗前后的变化，发现所有病人血清中p53抗体浓度在术后出现下降，且16个病人p53抗体由阳性转为阴性。
在大规模乳腺癌的研究中，Metcalfe等[40]检测了1006位病人治疗后血清样本中的p53抗体，跟踪的血清样本总数超过8000例，结果发现在155位p53抗体呈现阳性的病人，大部分治疗后p53抗体浓度并未出现减少或消失。这个结论似乎与先前研究相反。但是，作者认为这是因为病人的治疗并非采用手术切除，而是采用放射治疗的方式。一方面，肿瘤细胞依然残留；另一方面，放射治疗可能对正常组织细胞造成损伤而释放p53抗原，由于抗原的持续刺激并未消失，p53抗体仍处于阳性。这表明治疗方式可能有很大的影响，同样是乳腺癌，在另一项研究发现p53抗体在术后复发监测中具有重要价值[41]。
综上所述，p53自身抗体浓度会在手术（或其他治疗）后出现显著下降，并在复发前出现回升，其浓度变化跟疾病进程高度相关。虽然对于p53抗体阳性的肿瘤病人，大部分在术后会出现抗体浓度下降，但是p53在肿瘤病人中的阳性率仅为20%～30%。因此，作为术后评估较有意义。对于p53阴性的病人，则需要寻找新的自身抗体标志物。精准医疗是在充分考虑个体化差异的基础上提出来的，自身抗体的特征与肿瘤个体化差异的特点完全一致。若能比较手术前后，发现个体特异的自身抗体，即可实现个体化的复发监测，对于肿瘤防治具有重要意义。
4 发现自身抗体的方法和手段
自身抗体均是由其识别的抗原进行定义的，筛选、发现自身抗体（或抗原）的方法均基于免疫检测，本质上是抗原库的制备和免疫筛选的建立（图3）。抗原的来源包括重组表达蛋白、cDNA表达库、细胞或组织分离的蛋白质组；筛选方法主要是免疫印迹和高通量蛋白质芯片；后续基于测序或质谱的方式鉴定TAAs。主要的研究方法和工具方法如下。
图3 肿瘤自身抗体研究的方法[42]
4.1 SEREX
SEREX（serological analysis of tumor antigens by recombinant cDNA expression cloning）方法由Sahin等[43]于1995年建立，基于从病人的肿瘤组织获得总RNA，通过逆转录得到cDNA文库，建立噬菌体克隆库再转染到大肠杆菌中，通过固体培养和诱导表达重组蛋白并转移到膜上，对该病人的血清进行免疫检测，阳性克隆通过测序获得抗原信息[14]。目前，应用SEREX技术，已鉴定出多种TAAs[14，44]。但是该方法在建库的过程中往往存在蛋白表达不均衡，更偏向于表达组织中高丰度的抗原，导致一些低丰度蛋白难以检测。另外，整个实验过程步骤繁多，抗原库来源和血清的量都受到较大限制，因此不适用于大量样本的筛选，无法消除个体差异以及自身抗体多样性导致的偶然性。
类似的技术还有噬菌体库筛选[5，45]，不直接进行转膜和血清筛选，而是采用多血清和多轮筛选的方式，一般先进行健康对照，再进行病人血清样本的富集，获得的阳性克隆同样采用基因测序的方式获得抗原信息。
4.2 SERPA
SERPA（serological proteome analysis） 直接基于组织或细胞裂解液，通过二维电泳进行分离，并进行血清的免疫印迹，阳性或差异性的蛋白通过质谱得以鉴定[44-46]。该方法的优势是基于天然样本而非重组蛋白，因此能最大程度地保持蛋白的翻译后修饰（PTMs）和剪切体形式。但是同样存在蛋白丰度不均匀的问题，对于低丰度蛋白无法有效检测，另外，实验过程严重依赖人员操作，二维电泳和免疫印迹较难于重复。
4.3 MAPPing
MAPPing（multiple af fi nity protein pro fi ling）基于肿瘤组织和细胞裂解液，首先用磁珠固定的健康对照组的血清去除与之结合的蛋白，再使用来自肿瘤病人的血清捕获剩余的蛋白，然后通过质谱鉴定[44]。这种方法类似于噬菌体库筛选，不同的是抗原库源于天然样本，无法多次筛选和富集，存在一定的假阳性和假阴性。
4.4 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片（protein microarray）技术根据抗原库来源不同分为两种形式[14]。一是将特定抗体固定于芯片表面，首先捕获肿瘤组织或细胞裂解液中的蛋白，再基于高通量血清学检测获得差异性或阳性蛋白，通过抗体的特异性确定抗原信息。优势在于可以分析天然抗原和天然构象表位，但这种方法依赖于抗体的个数和质量，很难获得足够的抗原库。另外一种是重组蛋白质芯片，即将确定的重组蛋白直接固定于芯片表面，进而进行血清学筛选，这是最直接的一种方式，同时满足高通量和大量样本筛选的需求。但是获得足够种类的重组蛋白是一个瓶颈[44]。
5 蛋白质芯片在自身抗体检测及研究中的应用
蛋白质芯片，或蛋白质微阵列，是将多种蛋白质以阵列的形式排布和固定在固相表面。蛋白质芯片具有高通量、微型化、样本消耗少等优点。以目前的芯片技术，一张载玻片大小的芯片上可点制4万～6万个点，可承载巨大的抗原库，且由于每个点之间是独立的，可进行直接结果解读，适合高通量、大规模样本的筛选和检测[47]。
ProtoArray®芯片是来自Thermo Fisher Scienti fi c公司的一款高通量蛋白质芯片，包含约9000个重组人蛋白质，该芯片已经广泛应用于多种自身免疫性疾病和肿瘤的自身抗体的研究，包括慢性肾移植损伤、哮喘、结直肠癌和前列腺癌等[48]。
HuProtTM芯片同ProtoArray芯片相似，同是以纯化的、重组表达的蛋白质制备，但是蛋白个数更多，目前已达到20240个重组人蛋白，涵盖约16000个基因，是目前世界上最高通量的蛋白质芯片[47，49-50]。HuProtTM人类蛋白质组芯片由Johns Hopkins大学的朱衡教授团队开发，89%的蛋白为全长蛋白，部分蛋白包含多个不同的剪切体形式，通过高通量重组蛋白质制备方式获得，表达宿主是酵母，纯化方式为GST标签亲和纯化[50]。该款蛋白质芯片已应用于自身免疫性肝炎[51]、系统性红斑狼疮[52]、白塞病[53]等自身免疫性疾病，以及胃癌[54]、黑色素瘤[55]等恶性肿瘤的生物标志物的发现。
图4展示了基于HuProtTM芯片进行血清抗体检测的原理。首先，血清以一定稀释比例同封闭后的芯片进行孵育，并洗去未结合的抗体，再使用不同荧光标记的二抗同时检测IgG抗体亚型和IgM抗体亚型，然后通过荧光扫描仪读取各蛋白点的信号。
基于该款芯片，笔者课题组进行了胃癌自身抗体标志物研究[54]，在发现阶段筛选了37例胃癌患者和50例性别和年龄匹配的健康者，发现了17个新的潜在TAAs，其自身抗体浓度在胃癌患者中显著升高。接下来，针对这17个抗原，筛选了914例样本，包括300例胃癌患者，200例健康者，314例胃部良性病变样本，如胃溃疡、胃炎和息肉。通过大样本统计学验证，最终确定了4个胃癌相关自身抗原，分别是COPS2、CTSF、NT5E和TERF1，其中CTSF的曲线下面积（area under curve，AUC）达到0.96，针对健康者对照的诊断特异性和灵敏度分别是88%和96%。以上结果同时通过ELISA平台得到了验证。目前，正在同诊断公司合作进行该组标志物临床检测用试剂盒的开发。在另外一项研究中，Pan等[56]基于HuProtTM芯片筛选了大量肺癌病人的血清样本，经过发现、芯片验证、ELISA验证3个阶段，共检测了1101例血清，发现3个自身抗体标志物，对应抗原蛋白分别是p53、ETHE1和HRas，针对早期肺癌，检测灵敏度47.7%，特异性为90.8%。
图4 HuProtTM蛋白质芯片用于血清自身抗体标志物检测的原理
HuProtTM蛋白质组芯片在发现肿瘤自身抗体标志物方面有独特的优势。第一，蛋白质库较大，涵盖近80%的编码基因且89%的蛋白为全长蛋白，从而可保证抗原蛋白的三维构象。另外，高通量芯片使得检测过程异常简便，免去了抗原鉴定的复杂步骤，通过芯片扫描即可获取全部蛋白抗原的自身抗体信号。简便的过程使得系统误差较小，因此可保证实验的一致性。第二，适用于大规模样本筛选。微型化的芯片可同时进行多个样本的并行分析，传统方法则很难同时进行多个样本的检测。一方面自身抗体存在较大个体差异，小样本量筛选或将样本混合以获得统计学结果必然降低筛选的成功率；另一方面，在研究同一病人不同时间点的一系列样本时，需要同时检测多个样本。第三，所消耗的样本量较少。由于微型化，检测所有蛋白所需要的血清样本量仅为100μL以下，极大节省了宝贵的临床样本。因此，HuProtTM芯片是一个高效的自身抗体研究工具，可大大提高标志物筛选的覆盖率和效率，在疾病相关标志物发现领域有较大应用潜力。
6 总结和展望
肿瘤自身抗体的产生是肿瘤发生过程中机体免疫应答的结果。诸多研究表明，自身抗体往往出现在肿瘤发生的早期，因此具有真正意义上的早期诊断的潜力。目前，多个肿瘤相关性抗原已被发现和鉴定，并且肺癌早期筛查上已经出现了商业化产品。除此之外，自身抗体在术后监测过程中可能发挥更大的作用。自身抗体依赖于肿瘤的持续刺激而存在，因此，肿瘤被切除后，自身抗体逐渐减少，并维持在低浓度状态，在复发时浓度再次升高，因此自身抗体可用于复发监测；但是，由于个体差异，不同肿瘤病人的自身抗原可能不同，所以必须以精准医疗的思维实施个体化筛查和监测。然而，受限于研究工具和样本的可获得性，该类研究目前仅局限于p53等特定TAAs，目前并未进行广泛地筛选以建立全面覆盖的个体化复发监测的标志物组合。
肿瘤自身抗体研究依赖于抗原库，传统的方法已不能满足全局性的筛查和大规模样本验证。蛋白质芯片，特别是包含有约20000个重组人蛋白的HuProtTM芯片提供了高效的方式，可进行大量样本的快速筛选和验证，有望推动自身抗体作为标志物的研究进程。
肿瘤相关性自身抗体领域仍有诸多问题未被解决。比如，目前自身抗体产生的分子机制仍不清晰；所产生的自身抗体，是否具备抗肿瘤作用，还是具备其他功能。另外，在肿瘤免疫治疗的大背景下，有报道发现，自身抗体的存在与否可以预测免疫治疗的效果[57]，或许具备伴随诊断的价值。基于T细胞的免疫治疗研究进行得如火如荼，但仍只对部分人群有效，随着技术的进步和对肿瘤免疫机制研究的深入，或许将来基于自身抗体的免疫治疗也能成为一种有效的治疗方式。
参考文献
［1］ ETZONI R，URBAN N，RAMSEY S，et al. The case for early detection[J]. Nat Rev Cancer，2003，3（4）：243-252.
［2］ ACADEMY R Z C，ACAD C. Cancer Statistics in China，2015[J]. CA CANCER J CLIN，2016，66：115-132.
［3］ HANASH S M，BAIK C S，KALLIONIEMI O. Emerging molecular biomarkers-blood-based strategies to detect and monitor cancer[J]. Nat Rev Clin Oncol，2011，8（3）：142-150.
［4］ FINN O J. Immune response as a biomarker for cancer detection and a lot more[J]. N Engl J Med，2012，1288-1290.
［5］ WANG X，YU J，SREEKUMAR A，et al. Autoantibody signatures in prostate cancer[J]. N Engl J Med，2005，353（12）：1224-1235.
［6］ BALDWIN R W. Tumour-specific immunity against spontneous rat tumours[J]. Int J Cancer，1966，1（3）：257-264.
［7］ ZAENKER P，GRAY E S，ZIMAN M R. Autoantibody production in cancer——the humoral immune response toward autologous antigens in cancer patients[J]. Autoimmun Rev，2016，15（5）：477-483.
［8］ KONSOULOVA A. Principles of cancer immunobiology and immunotherapy of solid tumors[J]. Immunopathol Immunomodulation，2015：78-99.
［9］ SHARMA P，ALLISON J P. The future of immune checkpoint therapy[J]. Science，2015，348：56-61.
［10］ JULIEN S，VIDEIRA P A，DELANNOY P. Sialyl-Tn in cancer：(how)did we miss the target? [J]. Biomolecules，2012，2（4）：435-466.
［11］ CARMI Y，SPITZER M H，LINDE I L，et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity[J]. Nature，2015，521（7550）：99-104.
［12］ SHEN M，SUN Q，WANG J，et al. Positive and negative functions of B lymphocytes in tumors[J]. Oncotarget，2016，7（34）：55828-55839.
［13］ CASIANO C A，MEDIAVILLA-VARELA M，TAN E M. Tumorassociated antigen arrays for the serological diagnosis of cancer[J].Mol Cell proteomics，2006，5（10）：1745-1759.
［14］ DESMETZ C，MANGE A，MAUDELONDE T，et al. Autoantibody signatures：progress and perspectives for early cancer detection[J]. J Cell Mol Med，2011，15（10）：2013-2024.
［15］ SOUSSI T. p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer：a review[J]. Cancer Res，2000，60：1777-1788.
［16］ CRAWFORD L V，PIM D C，BULBROOK R D. Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer[J]. Int J Cancer，1982，30：403-408.
［17］ LUBIN R，ZALCMAN G，BOUCHET L，et al. Serum p53 antibodies as early markers of lung cancer[J]. Nat Med，1995，1（7）：701-702.
［18］ ZALCMAN G，SCHLICHTHOLZ B，TRÉDANIEL J，et al.Monitoring of p53 autoantibodies in lung cancer during therapy：relationship to response to treatment[J]. Clin Cancer Res，1998，4（6）：1359-1366.
［19］ PAN X，GAO Y，LIU J，et al. Progress in studies on autoantibodies against tumor-associated antigens in hepatocellular carcinoma[J].Transl Cancer Res，2016，5（6）：845-859.
［20］ BROODMAN I，LINDEMANS J，VAN STEN J，et al. Serum protein markers for the early detection of lung cancer：a focus on autoantibodies[J]. J Proteome Res，2017，16（1）：3-13.
［21］ ZHANG H，XIA J，WANG K，et al. Serum autoantibodies in the early detection of esophageal cancer：a systematic review[J]. Tumour Biol，2015，36（1）：95-109.
［22］ CHEN H，WERNER S，TAO S，et al. Blood autoantibodies against tumor-associated antigens as biomarkers in early detection of colorectal cancer[J]. Cancer Lett，2014，346（2）：178-187.
［23］ ZHANG J Y，ZHU W，IMAI H，et al. De-novo humoral immune responses to cancer-associated autoantigens during transition from chronic liver disease to hepatocellular carcinoma[J]. Clin Exp Immunol，2001，125（1）：3-9.
［24］ LIU M，ZHENG S J，CHEN Y，et al. Autoantibody response to murine double minute 2 protein in immunodiagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. J Immunol Res，2014. DOI：10.1155/2014/906532.
［25］ HONG Y，HUANG J. Autoantibodies against tumor-associated antigens for detection of hepatocellular carcinoma[J]. World J Hepatol，2015，7（11）：1581-1585.
［26］ DAI L，REN P，LIU M，et al. Using immunomic approach to enhance tumor-associated autoantibody detection in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Clin Immunol，2014，152（1-2）：127-139.
［27］ ZHANG J Y，CHAN E K，PENG X X，et al. A novel cytoplasmic protein with RNA-binding motifs is an autoantigen in human hepatocellular carcinoma[J]. J Exp Med，1999，189（7）：1101-1110.
［28］ ZHANG J Y，MEGLIORINO R，PENG X X，et al. Antibody detection using tumor-associated antigen mini-array in immunodiagnosing human hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol，2007，46：107-114.
［29］ JETT J R，PEEK L J，FREDERICKS L，et al. Audit of the autoantibody test，EarlyCDT®-Lung，in 1600 patients：an evaluation of its performance in routine clinical practice[J]. Lung Cancer，2014，83（1）：51-55.
［30］ CHAPMAN C J，HEALEY G F，MURRAY A，et al. EarlyCDT®-Lung test：improved clinical utility through additional autoantibody assays[J]. Tumor Biol，2012，33（5）：1319-1326.
［31］ SOUSSI T. p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer ：a review[J]. Cancer Res，2000，60：1777-1788.
［32］ KUNIZAKI M，FUKUDA A，WAKATA K，et al. Clinical significance of serum p53 antibody in the early detection and poor prognosis of gastric cancer[J]. Anticancer Res，2017，37（4）：1979-1984.
［33］ MITSUDOMI T，SUZUKI S，YATABE Y，et al. Clinical implications of p53 autoantibodies in the sera of patients with nonsmall-cell lung cancer[J]. J Natl Cancer Inst，1998，90（20）：1563-1568.
［34］ ANDERSON K S，WONG J，VITONIS A，et al. p53 Autoantibodies as potential detection and prognostic biomarkers in serous ovarian cancer[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19（3）：859-868.
［35］ MORELL A，TERRY W D，WALDMANN T A. Metabolic properties of IgG subclasses in man[J]. J Clin Invest，1970，49：673-680.
［36］ HAMMEL P，BOISSIER B，CHAUMETTE M，et al. Detection and monitoring of serum p53 antibodies in patients with colorectal cancer[J]. Gut，1997，40：356-361.
［37］ ZALCMAN G，SCHLICHTHOLZ B，TREDANIEL J，et al.Monitoring relationship autoantibodies in lung cancer during therapy ：to response to treatment[J]. Clin Cancer Res，1998，4：1359-1366.
［38］ SAFFROY R，LELONG J，AZOULAY D，et al. Clinical signi fi cance of circulating anti-p53 antibodies in European patients with hepatocellular carcinoma[J]. Br J Cancer，1999，79：604-610.
［39］ TAKEDA A，SHIMADA H，NAKAJIMA K，et al. Serum p53 antibody as a useful marker for monitoring of treatment of super fi cial colorectal adenocarcinoma after endoscopic resection[J]. Int J Clin Oncol，2001，6：45-49.
［40］ METCALFE S，WHEELER T K，PICKEN S，et al. p53 Autoantibodies in 1006 patients followed up for breast cancer[J].Breast Cancer Res，2000，2（6）：438-443.
［41］ REGELE S，VOGL F D，KOHLER T，et al. p53 Autoantibodies can be indicative of the development of breast cancer relapse[J].Anticancer Res，2003，23（1b）：761-764.
［42］ HEO C K，BAHK Y Y，CHO E W. Tumor-associated autoantibodies as diagnostic and prognostic biomarkers[J]. BMB Rep，2012，45（12）：677-685.
［43］ SAHIN U，TURECI O，SCHMITFR H，et al. Human neoplasms elicit multiple speci fi c immune responses in the autologous host[J].Proc Natl Acad Sci，1995，92：11810-11813.
［44］ TAN H T，LOW J，LIM S G，et al. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection[J]. FEBS J，2009，276：6880-6904.
［45］ LIU H，ZHANG J，WANG S，et al. Screening of autoantibodies as potential biomarkers for hepatocellular carcinoma by using T7 phase display system[J]. Cancer Epidemiol，2012，36（1）：82-88.
［46］ TOYE A M，PARSONS S F，ANSTEE D J，et al. Immunoseroproteomic pro fi ling in African American men with prostate cancer：evidence for an autoantibody response to glycolysis and plasminogen-associated proteins[J]. Mol Cell Proteomics，2016（909）：1-28.
［47］ ZHU H. Global analysis of protein activities using proteome chips[J].Science，2001，293（5537）：2101-2105.
［48］ AYOGLU B，SCHWENK J M，NILSSON P. Antigen arrays for profiling autoantibody repertoires[J]. Bioanalysis，2016，8（10）：1105-1126.
［49］ HU S，LI Y，LIU G，et al. A protein chip approach for highthroughput antigen identification and characterization[J].Proteomics，2007，7（13）：2151-2161.
［50］ JEONG J S，JIANG L，ALBINO E，et al. Rapid identification of monospeci fi c monoclonal antibodies using a human proteome microarray[J].Mol Cell Proteomics，2012. DOI：10.1074/mcp.0111.016253.
［51］ HU C J，SONG G，HUANG W，et al. Identification of new autoantigens for primary biliary cirrhosis using human proteome microarrays[J]. Mol Cell Proteomics，2012，11（9）：669-680.
［52］ HU C，HUANG W，CHEN H，et al. Autoantibody profiling on human proteome microarray for biomarker discovery in cerebrospinal fl uid and sera of neuropsychiatric lupus[J]. PLoS One，2015，10（5）：e0126643.
［53］ HU C J，PAN J B，SONG G，et al. Identi fi cation of novel biomarkers for behcet disease diagnosis using human proteome microarray approach[J]. Mol Cell Proteomics，2017，16（2）：147-156.
［54］ YANG L，WANG J，LI J，et al. Identification of serum biomarkers for gastric cancer diagnosis using a human proteome microarray[J].Mol Cell Proteomics，2016，15（2）：614-623.
［55］ SYED P，GUPTA S，CHOUDHARY S，et al. Autoantibody pro fi ling of glioma serum samples to identify biomarkers using human proteome arrays[J]. Sci Rep，2015，5：13895.
［56］ PAN J，SONG G，CHEN D，et al. Identification of serological biomarkers for early diagnosis of lung cancer using a protein array-based approach[J]. Mol Cell Proteomics，2017，16（12）：2069-2078.
［57］ Oncimmune and scancell present data on use of autoantibodies in predicting response to SCIB1 immunotherapy[EB/OL]. [2017-08-29]. http：//www.scancell.co.uk/news/regulatory-news/oncimmune-andscancell-present-data.
转载自《生物产业技术》2018. 02（3月）//www.biobusiness.com.cn/